Stem Cells and Tissue Engineering Techniques

Cellule Staminali Normali

Allo stato attuale è ampiamente accettato il concetto che la formazione, il mantenimento, la riparazione e la rigenerazione tessutale siano dovuti ad un piccolo subset cellulare, le CS.

Le CS sono altamente immature, e quindi non differenziate; sono governate da programmi genici che mantengono il loro stato di immaturità, anche se si ritiene che questi programmi possano differire nei vari tipi di staminali. Tuttavia da esse si originano elementi che imboccano la via del differenziamento (cellule progenitrici, CP) e che rappresentano i capostipiti dei diversi lineage dando quindi origine a cellule dotate di caratteristiche morfologiche, biochimiche e funzionali tipiche degli elementi specializzati.

Le CS risiedono nell'embrione, ma sono presenti anche nella vita post-natale e nei tessuti adulti. Altre fonti di CS sono rappresentate dal cordone ombelicale, dal liquido amniotico e dalla placenta.

Le CS embrionali sono pluripotenti, nel senso che possono differenziarsi in tutti i tipi cellulari, ad eccezione del trofoblasto, lo strato esterno della blastocisti che presiede alla costituzione della placenta. Le CS residenti nell'individuo adulto sono multipotenti, in quanto possono differenziarsi in genere solo negli elementi del tessuto cui appartengono. Lo zigote è la sola cellula staminale totipotente, in quanto da esso effettivamente discendono, attraverso le divisioni di segmentazione ed i primi eventi differenziativi, sia il trofoblasto che l'embrioblasto e da quest'ultimo i tre foglietti embrionali: l'ectoderma, l'entoderma ed il mesoderma, dai quali originano tutti i tessuti del corpo umano.

La principale proprietà delle CS è l'autorinnovamento e cioè la capacità quasi illimitata di duplicarsi. Il mantenimento del compartimento staminale si ritiene sia dovuto alla possibilità di andare incontro a due tipi di divisione cellulare: asimmetrica e simmetrica. Nella prima modalità una cellula staminale genera una cellula identica a se stessa, che provvede a mantenere numericamente adeguato il pool di elementi immaturi, mentre l'altra (CP) è in grado, attraverso diversi passaggi, di differenziarsi, rispondendo a ben precise necessità funzionali e sotto il controllo di una ben determinata serie di fattori. Le CP inizialmente mantengono le peculiarità della cellula madre, ma, successivamente, perdono in maniera graduale il loro potenziale duplicativo. Nella seconda modalità di divisione, invece, la cellula staminale genera due elementi che possiedono le sue stesse caratteristiche (1–3).

Le CS sono in grado di preservarsi resistendo agli insulti esterni e possiedono sistemi molto efficaci per il riparo del DNA e per l'estrusione o l'inattivazione dei farmaci, oltre ad essere resistenti alle radiazioni (4).

Funzionalmente, per quanto riguarda le CS presenti nei tessuti adulti, si possono distinguere le staminali che provvedono regolarmente al rinnovamento tessutale, sostituendo le cellule terminalmente differenziate una volta che esse muoiano e vengano eliminate (come accade ad esempio negli epiteli di rivestimento o nel midollo osseo per la formazione degli elementi figurati del sangue), da quelle che vengono attivate solo in condizioni particolari. In questo secondo caso le CS entrano in azione a seguito di stimoli definiti e possono rimpiazzare il tessuto danneggiato o andato perduto (riparazione e rigenerazione) (5).

La percentuale di CS presenti nei diversi tessuti adulti è minima e la sede in cui esse sono collocate è ben definita nell'ambito degli stessi tessuti; ad esempio, nell'epitelio endometriale esse si posizionano nel fondo delle ghiandole uterine.

Il microambiente che circonda le CS, denominato nicchia, assume un ruolo determinante nel mantenimento delle caratteristiche di queste cellule e le indirizza verso uno o l'altro tipo di divisione cellulare che esse possono teoricamente intraprendere. La nicchia protegge le cellule staminali, mettendole al riparo da influenze esterne. Le CS rimangono quiescenti in tale nicchia finché non si profili una richiesta di rinnovamento funzionale del tessuto o un danno da riparare. Si ipotizza che modificazioni della nicchia possano essere coinvolte nella trasformazione delle CS normali in cellule staminali tumorali (CST) (6).

Nella nicchia sono presenti cellule nutrici che emettono dei segnali specifici (fattori di crescita e/o differenziazione) e che giacciono su di una membrana basale alla quale aderiscono sul versante opposto le CS mediante recettori integrinici. La nicchia è servita da una specifica innervazione ed irrorazione.

Recenti risultati sperimentali indicano che una progenie di cellule staminali commissionate possa essere una componente indispensabile della nicchia (7).

L'autorinnovamento delle CS è mantenuto da una serie di segnali, la cui mancata regolazione può condurre alla costituzione di CST. In questo processo sono implicati, oltre a Wnt, Notch, LIF, PTEN, SHH, BMI1 (8, 9).

Tra i geni che controllano il passaggio da CS a CP intervengono OCT-4, Wnt/beta catenina, Notch, BMP e chinasi della famiglia Janus (5).

Sia le CS che le CP possono produrre cellule figlie che esprimono vari livelli di maturità e questa proprietà, detta plasticità, è legata al microambiente in cui vengono a trovarsi e consente di dare vita a tipi cellulari. non presenti nel tessuto di origine delle CS stesse (10).

In particolare, il midollo osseo rappresenta una fonte di CS che generalmente danno origine ad elementi maturi del sangue, ma che, in particolari condizioni, possono generare osteoblasti, condroblasti ed adipociti e, con bassa frequenza, anche cellule muscolari scheletriche, cardiache e lisce o addirittura neuroni e cellule epiteliali (5, 11). CS sono state isolate dal tessuto muscolare ed anche dal tessuto nervoso sia nel corso dello sviluppo che nell'individuo adulto.

Le CS possono essere identificate sulla base dell'espressione di marker di staminalità e quindi di immaturità che non sono presenti nelle cellule somatiche; spesso però si verifica una sovrapposizione di tale espressione nei differenti lineage e quindi non si può classificare una cellula staminale sulla base di un singolo marker (12).

Le prospettive aperte dalla ricerca sulle CS sono veramente sorprendenti. In molte malattie genetiche o acquisite in età matura, le CS residenti in un determinato tessuto possono aver esaurito la loro capacità proliferativa o essere state irrimediabilmente danneggiate e quindi non essere in grado di contribuire al rinnovamento tessutale. Si può tentare in questi casi di isolare le CS da un altro tessuto adulto e, dopo averle indotte a differenziare nel tipo cellulare desiderato, usarle per riparare il tessuto leso. Ovviamente le CS devono essere veicolate al tessuto danneggiato in modo selettivo. Si possono anche utilizzare CS non spinte a differenziare, ma in questo caso è necessario che esse differenzino in situ, dopo essere sopravvissute. Il midollo osseo viene raggiunto mediante un homing spontaneo, ma, per tutti gli altri organi, è necessaria l'iniezione intratessutale o per via ematica.

All'impiego terapeutico delle CS sono legati problemi di tumorigenicità ed incompatibilità immunologica.

Inoltre, l'uso di CS embrionali umane ha giustamente sollevato delle questioni di tipo etico e numerose polemiche, in quanto il prelievo della massa cellulare interna implica la distruzione dell'embrione.

In rapporto a questa problematica si è cercato di sviluppare, ma senza successo, tecniche che evitino appunto la distruzione della massa cellulare interna; peraltro queste procedure richiedono grandi abilità nella micromanipolazione degli embrioni stessi.

Le CS adulte hanno il vantaggio di non sollevare problematiche etiche e non transdifferenziano in un fenotipo maligno (13).

Esiste inoltre la possibilità della riprogrammazione, processo mediante il quale una cellula differenziata viene riprogrammata in un elemento (cellula pluripotente) capace di generare numerosi tipi cellulari. La riprogrammazione può essere ottenuta impiegando varie tecniche: il transfer nucleare di una cellula somatica, il transfer nucleare alterato, la fusione cellulare, l'uso di estratti di singole cellule e l'uso della trasfezione retrovirale di certi fattori (13).

In particolare, il transfer nucleare, ampiamente sperimentato nell'animale ai fini della cosidetta “clonazione terapeutica”, consiste nel trasferimento del nucleo di una cellula somatica di un individuo in una cellula uovo messa a disposizione da una donatrice e deprivata del proprio nucleo. La cellula ricostituita viene indotta a dividersi (impiegando, ad esempio, delle piccole scosse elettriche) e viene mantenuta in vitro fino allo stadio di blastocisti. A questo punto si preleva la massa cellulare interna dalla quale si possono ottenere le CS che hanno lo stesso patrimonio genetico dell'individuo da cui è stato prelevato il nucleo della cellula somatica. Questo consente di evitare i problemi relativi alla incompatibilità immunologica nell'uso delle CS (2).

Il transfer nucleare può essere impiegato anche in quella che viene definita “clonazione riproduttiva”. La blastocisti ottenuta può infatti essere impiantata nell'utero di una madre surrogata e procedere nello sviluppo fino alla nascita di un nuovo individuo.

Nel 2006 Takahashi e Yamanaka hanno generato CS pluripotent (induced pluripotent stem cells, iPSC) direttamente da fibroblasti embrionali ed adulti di topo mediante la trasfezione retrovirale di 4 fattori di trascrizione: Oct 4, Sox 2, KLF 4 e c-myc (14). A seguito di questi risultati, iPSC sono state ottenute dall'uomo, dalla scimmia e dal ratto e sono stati identificati fattori di trascrizione alternativi e piccoli composti chimici che possono sostituire i fattori di trascrizione e aumentare l'efficienza della riprogrammazione (15). Queste evidenze sperimentali dimostrano che lo stato differenziato che caratterizza la maggior parte delle cellule di un organismo non è stabile e che la transdifferenziazione non è un fenomeno al quale si può assistere solo in alcuni casi, come la metaplasia.

Cellule Staminali Tumorali

Esistono molte similitudini tra i meccanismi molecolari che controllano la proliferazione e la differenziazione delle CS e quanto accade nello sviluppo dei tumori e questo ha condotto ad ipotizzare che la genesi del cancro sia attribuibile all'esistenza di una versione mutata di CS, le CST.

Il tumore quindi si svilupperebbe non da una cellula qualunque della popolazione tessutale che vada incontro ad una raccolta di mutazioni (modello stocastico) ma proprio da CST, che possono generare elementi più o meno differenziati a seconda delle influenze subite all'interno della massa tumorale (modello gerarchico) (16).

La piccola frazione cellulare rappresentata dalle CST ha proprietà tumorigeniche ed è quindi in grado di far sviluppare il tumore in animali immunocompromessi; sarebbe inoltre responsabile della progressione della neoplasia e delle recidive dopo i trattamenti convenzionali (16).

Data la resistenza alla chemio e radioterapia delle CST, si può ipotizzare che questi trattamenti colpiscano in maniera più o meno significativa le componenti tumorali ad eccezione delle CST stesse che quindi sarebbero in grado di promuovere l'accrescimento del tumore e la sua disseminazione a distanza. Di qui il notevole interesse sorto nei confronti della possibilità di individuare dei trattamenti che abbiano come obiettivo le CST, eradicando il tumore.

Se si accetta il modello gerarchico della genesi del cancro, potrebbe essere spiegata più facilmente l'eterogeneità tumorale che si manifesta a livello morfologico e genetico nonché in termini di espressione di marker tumorali e di comportamento clinico (17).

Le CST possono essere individuate e separate all'interno del tumore sulla base dell'espressione di marker di superficie associati all'immaturità cellulare.

Allo stato esse sono state isolate non solo da tumori del sangue, ma anche da tumori solidi, quali il cancro della mammella, i tumori cerebrali, il cancro dello stomaco e del colon, i tumori testa-collo, il melanoma, il cancro della tiroide, del polmone, della prostata, della vescica, del rene, etc.

La biologia delle CST, al pari di quella delle CS normali, richiede ancora di essere esplorata approfonditamente, in particolare per quanto concerne i meccanismi di autorinnovamento e differenziamento, in vista dell’ identificazione di nuove opzioni terapeutiche.

Ingegneria tessutale

L'ingegneria tessutale è un campo interdisciplinare in cui si fondono conoscenze di ingegneria con conoscenze derivanti dalle scienze biologiche allo scopo di riparare o sostituire i tessuti. Essa prevede un approccio acellulare ed uno cellulare.

L'approccio acellulare implica l'uso di matrici naturali o sintetiche denominate “scaffolds”. Queste matrici stimolano la capacità naturale dell'organismo di andare incontro a riparazione ed indirizzare la crescita dei nuovi tessuti in maniera tale che venga rispettato l'assetto architettonico di origine.

L'approccio cellulare implica l'uso di cellule che possono essere autologhe od eterologhe e che possono anche essere associate ad uno scaffold.

Quest'ultimo può essere usato come carrier di fattori di crescita che favoriscono il processo rigenerativo.

Il collagene che forma talune matrici viene lentamente degradato e rimpiazzato dalla matrice extracellulare dell'ospite (18).

Insufficienza renale acuta e cronica

È stato dimostrato che CS derivate dal midollo osseo (Bone Marrow Stem Cells, BMSC) manifestano un effetto protettivo nei confronti del danno renale indotto da cisplatino (20) mentre non sembrano dare un contributo significativo alla rigenerazione dell'epitelio in un modello di grave ischemia renale (21). Tuttavia, il tessuto renale danneggiato può indurre la differenziazione in vitro ed in vivo di BMSC sia murine sia umane in cellule simili all'epitelio tubulare e BMSC umane possono migrare e raggiungere le regioni danneggiate curando efficacemente l'insufficienza renale acuta nel ratto (22).

In un modello di ischemia renale acuta dello stesso animale, CS derivate da tessuto renale adulto hanno manifestato la capacità di differenziare sia in vitro che in vivo in cellule endoteliali e muscolari. Inoltre, iniezioni intraparenchimali di CS mesenchimali (CSM) hanno prodotto l'aumento del flusso sanguigno nella microcircolazione e diminuito il livello di alterazione dei tubuli renali (23, 24).

Anche i risultati ottenuti utilizzando le CS in modelli murini di insufficienza renale cronica sembrano promettenti. Infatti è stato dimostrato che le CS possono prevenire la perdita dei capillari peritubulari, ridurre i marker di fibrosi renale ed attenuare la progressione della proteinuria (25, 26). Inoltre, le CS sembrano aver un ruolo nel modulare la risposta infiammatoria nella fase iniziale del danno renale cronico (27).

In contrasto con questi risultati, è stato dimostrato che BMSC ottenute da ratti con insufficienza renale cronica non proliferano in vitro (28).

Ricostruzione del tessuto renale

Vari tentativi sono stati fatti nell'ottica di ricostruire l'unità funzionale renale. Lanza et al hanno impiegato cellule renali derivate da un feto bovino clonato, ai primi stadi dello sviluppo, allo scopo di ottenere tessuti renali immunocompatibili. Le cellule renali clonate sono state espanse in vitro e reimpiantate nell'animale donatore del nucleo. Esse si sono organizzate in glomeruli ed in strutture simil-tubulari capaci di eliminare prodotti tossici di rifiuto mediante il flusso di un liquido simile all'urina e non si è verificato alcun rigetto (29).

In un altro studio, il rene di un ratto è stato privato delle cellule in modo da lasciare intatta la matrice extracellulare. Quindi CS embrionali murine sono state depositate in questa matrice ed esse sono andate incontro a proliferazione e a differenziazione, messe in evidenza mediante tecniche istologiche ed immunoistochimiche (30).

Tiranathanagul et al hanno costruito un device bioartificiale impiantabile atto a filtrare il sangue allo scopo di rimpiazzare la funzione glomerulare nel ratto. I loro esperimenti hanno dimostrato che si può sviluppare un neo-tessuto ben vascolarizzato capace di produrre un fluido simile all'ultrafiltrato glomerulare (31).

Ricostruzione della vescica, dell'uretere e dell'uretra

Varie condizioni patologiche possono alterare la struttura normale della vescica e determinare uno svuotamento inadeguato dell'organo. In questi casi si tenta di ripristinare la funzionalità tramite intervento chirurgico, ma le complicanze sono numerose. La ricostruzione della vescica mediante l'uso di un'ansa intestinale defunzionalizzata può comportare complicazioni quali l'eccessiva produzione di muco, i disturbi metabolici, la litiasi.

L'impiego dell'ingegneria tessutale potrebbe offrire delle soluzioni per il trattamento delle diverse patologie e risolvere anche il problema dei trapianti. La ricerca in questo ambito è ancora ai suoi primi passi, ma sono stati ottenuti risultati promettenti che fanno sperare per il futuro.

L'uso di matrici acellulari ha avuto successo nell'aumentare il volume vescicale in piccoli animali, ma non ha dato buoni risultati in animali più grandi quali i cani o i maiali (32).

L'aggiunta di fattori di crescita alle matrici ha stimolato la rigenerazione vescicale nei topi ed il trattamento con chitosano ha migliorato la rigenerazione del tessuto nervoso e le proprietà della matrice (33, 34).

Le CS possono essere indotte a differenziare in urotelio in vitro e, se vengono co-coltivate insieme a cellule uroteliali e a cellule muscolari lisce, può essere aumentato il “cell seeding” nelle matrici (35).

Recentemente CS adulte sono state impiegate per generare ampie popolazioni di cellule muscolari lisce che possono essere seminate in supporti sintetici (36).

Inoltre sono state identificate popolazioni di CSM derivate da midollo osseo e CP endoteliali che esprimono proprietà contrattili simili a quelle degli elementi cellulari della parete vescicale e che potrebbero essere impiegate in esperimenti di rigenerazione (37). Tian et al hanno dimostrato che CSM derivate dal midollo osseo possono differenziare in cellule muscolari lisce se seminate su di uno scaffold altamente poroso e trattate con Platelet Derived Growth Factor e Transforming Growth Factor beta (38).

Il primo studio clinico che ha applicato tecniche rigenerative nell'uomo è stato condotto da Atala et al, i quali in sette pazienti affetti da vescica neurologica secondaria a mielomeningocele hanno utilizzato cellule uroteliali autologhe e cellule muscolari lisce, ottenute mediante biopsia. Tali cellule erano state espanse in vitro e seminate su di una matrice artificiale prima dell'impianto. Gli autori hanno riportato la fattibilità di questa procedura in caso di pazienti bisognosi di cistoplastica (39).

In un altro studio CSM sono state usate in sette pazienti affetti da cistite emorragica. In cinque casi di patologia lieve è stata registrata la scomparsa della sintomatologia; in un caso più grave la perforazione della parete è rimarginata, mentre in un altro caso ancora l'uso delle staminali ha ridotto la necessità di trasfusioni (40).

Per quanto concerne l'uretere, Osman et al hanno utilizzato una matrice canina, dopo decellularizzazione, per rimpiazzare un tratto di tre centimetri dell'organo, ma i risultati sono stati non confortanti; infatti è stato osservato un marcato accorciamento del tratto in questione ed un restringimento del lume, fino ad una completa occlusione con estesa fibrosi (41).

Matrici arricchite di vari tipi di cellule sono state impiegate allo scopo di migliorare la funzionalità dell'uretere. I risultati ottenuti con cellule uroteliali non sono stati confortanti; al contrario, utilizzando cellule mononucleate derivate dal midollo osseo supportate da matrici, si è ottenuta neovascolarizzazione (42, 43).

L'ingegneria tessutale sembra offrire delle prospettive nel trattamento dei restringimenti uretrali. Molti tipi di scaffold sono stati impiegati sia in ambito sperimentale che clinico. Matrici acellulari ottenute da vescica sono state paragonate a trapianti di mucosa buccale in restringimenti uretrali complessi; le matrici sembrerebbero rappresentare un'opzione utile alla riparazione anche se sono risultate meno efficaci della mucosa buccale (44). La ricostruzione dell'uretra è stata condotta con successo nei conigli usando trapianti di matrice vescicale acellulare in cui sono stati seminati cheratinociti orali autogeni (45).

Incontinenza urinaria

In tutto il mondo più di 200 milioni di uomini e donne soffrono di incontinenza urinaria e la forma più diffusa di questa patologia è l'incontinenza urinaria da stress. Un meccanismo critico per mantenere la continenza è la conservazione dello sfintere striato. In questa ottica è stata impiegata la terapia cellulare (ad es. mioblasti) e CS di vario tipo e cioè ottenute dal muscolo o da altri tessuti adulti. Le cellule impiantate possono anche rilasciare fattori trofici che promuovono l'integrazione dei nervi nel muscolo stesso.

Si attendono i risultati definitivi di alcuni studi clinici sulla utilizzazione di CSM in pazienti affetti da incontinenza da stress o altri tipi di incontinenza (46).

Malattia di Peyronie

Risultati positivi sono stati riportati con l'ingegneria tessutale usando “scaffolds” arricchiti o meno di cellule nel trattamento dei difetti della tonaca albuginea. Nei cani è stato impiegato il trapianto di matrice acellulare derivata dall'albuginea ottenendo una erezione efficace (47). Purtroppo l'applicazione clinica nell'uomo ha dato il 37% di complicazioni secondo Breyer et al (48). Nello studio in questione diciannove pazienti sono stati sottoposti ad una sostituzione della tonaca albuginea con uno strato di sottomucosa intestinale porcina per correggere un incurvamento del pene causato da malattia di Peyronie. Il 53% dei pazienti ha manifestato disfunzione erettile postoperatoria, il 37% incurvamento ricorrente del pene, il 26% placca di Peyronie ricorrente, il 26% ematoma ed infine il 5% ha sviluppato infezioni.

Disfunzione erettile

L'ingegneria tessutale è stata impiegata anche nel trattamento della disfunzione erettile ed in particolare nella sostituzione dei corpi cavernosi e dei nervi cavernosi (13). BMSC trasfettate con fattore neurotrofico derivato dal cervello possono ripristinare la funzione erettile in ratti con nervi cavernosi danneggiati. Lo stesso tipo di cellule ha migliorato la funzione erettile nei ratti e, quando trapiantato nei corpi cavernosi, si è differenziato in elementi endoteliali e muscolari (49).

Sterilità maschile

CS embrionali possono formare cellule germinative maschili in vitro e possono partecipare alla spermatogenesi quando impiantate in tubuli seminiferi ricostituiti (50).

West et al hanno pubblicato un protocollo dettagliato per la derivazione in vitro di cellule germinative da CS murine embrionali (51). Inoltre, Nayernia et al hanno dimostrato che possono nascere topi vitali da cellule germinative ottenute da staminali embrionali (52).

BMSC sono state impiegate nel trattamento dell'infertilità maschile e della deficienza di testosterone. La capacità di queste cellule di differenziare in cellule germinative maschili è stata dimostrata sia negli animali che nell'uomo. Cellule germinative, cellule di Sertoli e cellule di Leydig sono state ottenute da BMSC trapiantate nel testicolo di un topo infertile trattato con busulfano (13, 53).

Impiego di staminali nel trattamento dei tumori urologici

In realtà, anche questo argomento meriterebbe un'ampia trattazione, ma per dare risalto all'importanza dell'uso terapeutico delle CS, si farà riferimento ad un solo interessante impiego, il trapianto non mieloablativo di CS allogeniche nel trattamento di pazienti affetti da carcinoma renale metastatico. Questa patologia è resistente alla chemioterapia convenzionale e alla radioterapia. Alcuni lavori hanno dimostrato che con l'approccio in questione si possono ottenere remissioni parziali o totali, ma esso rimane francamente sperimentale, allo stato, e riservato a pazienti ricoverati in centri altamente specializzati e di grande esperienza. La stessa selezione dei pazienti deve essere molto accurata, poiché costituisce un fattore assolutamente critico (54).